附錄Ⅻ A 無菌檢（jiǎn）查（chá）法
無菌檢查法係（xì）用於檢（jiǎn）查（chá）藥典要求（qiú）無菌的生（shēng）物製品、醫療器具、原料、輔料、及其他品種（zhǒng）是（shì）否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規定,僅表明（míng）了供試品在該檢驗條件下未（wèi）發現微生（shēng）物汙（wū）染。
無菌檢查（chá）應在環境潔淨度 10 000 級（jí）下的（de）局部潔（jié）淨（jìng）度 100 級的單向流空氣區域內或隔離係統中進行，其全過（guò）程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染，防止汙染的措施不得影（yǐng）響供試（shì）品中微生物的檢出。單向流空氣（qì）區、工作台麵及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮遊菌（jun1）和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。隔離係統應按相關的要求進行驗證，其內部環境（jìng）的（de）潔淨度（dù）須符合無菌（jun1）檢查（chá）的要求。日常檢驗還（hái）需對試驗環境進行監控。
無菌（jun1）檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。
培養基
培養基的製備（bèi）
培養基可按以下（xià）處方製備，亦可使用（yòng）按該處（chù）方生產的符（fú）合規定（dìng）的脫水培養基。配製後應采用（yòng）驗（yàn）證合格的滅菌程序滅菌。製備好的培養基應保存在 2℃～ 25℃、避光的環境，若（ruò）保存（cún）於非密閉容器中，一般在三周內使（shǐ）用；若保存於密閉容器中，一（yī）般（bān）可（kě）在（zài）一（yī）年內使用（yòng）。
1. 硫乙醇酸鹽流體培養基
酪腖 (胰酶水解) 15.0g 酵母（mǔ）浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯（lǜ）化鈉 2.5g
L-胱氨酸（suān） 0.5g 新配製的 0.1% 刃天青溶液 1.0 ml
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫（liú）乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天青（qīng）溶液外，取上（shàng）述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性（xìng），煮沸（fèi），濾清，加入葡萄糖和刃天青溶（róng）液，搖勻，調節 pH 值使滅菌後為 7.1 ± 0.2 。分裝至適宜的容器中，其（qí）裝（zhuāng）量與（yǔ）容器（qì）高度的比例應符合培養結（jié）束後培（péi）養（yǎng）基氧化層（粉紅色）不超過培養基深（shēn）度的 1/2 ，滅菌。在供試品接種前，培養基氧化（huà）層的高度不得超過培（péi）養基深度（dù）的 1/5 ，否則，須（xū）經 100 ℃水浴加熱至粉紅色（sè）消失（不超（chāo）過 20 分鍾），迅速冷卻，隻限加熱一次，並（bìng）防止被汙染。
2.改良馬丁培養基
腖 5.0g 磷酸氫二鉀 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸鎂 0.5g
葡（pú）萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成分混（hún）合，微溫溶解，調（diào）節 pH 值約為 6.8 ，煮（zhǔ）沸，加入葡（pú）萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 6.4 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
3.選擇性（xìng）培養基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養（yǎng）基（jī）或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜（yí）的中和劑、滅活劑或表麵活性劑，其用（yòng）量同驗證試驗。
4.營養肉湯培養基
腖 10.0g 氯化鈉 5.0g
牛肉浸（jìn）出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微溫溶解（jiě），調節（jiē） pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
5. 營養瓊脂（zhī）培養基
按上述營養肉湯培養基的處方及製（zhì）法，加入 14.0g瓊脂，調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
6. 改良馬丁瓊脂培養（yǎng）基
按改良馬丁培養基的處方（fāng）及製法（fǎ），加入 14.0g瓊脂，調節 pH值使滅菌後為 6.4 ± 0.2，分裝，滅菌。
培養基的適用性檢查
無菌檢查用的硫乙（yǐ）醇酸鹽流體培養（yǎng）基及改良馬丁培（péi）養基應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求（qiú）。本檢查可在供試品的無菌檢查前或（huò）與供試品的無菌檢查同時進（jìn）行。
無菌性檢查 每（měi）批培養基（jī）隨機抽取不少於（yú） 10 支（瓶），5支（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶）置20℃～25℃培養 14 天，均應無菌生長.
靈敏度（dù）檢查
菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次（cì）數不得超（chāo）過 5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍幹（gàn）燥菌種為第 0 代），試驗用（yòng）菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株（zhū）的生物學特性。
金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠（lǜ）假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠（zhū）菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲黴( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液製備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯（kū）草芽孢杆（gǎn）菌（jun1）的（de）新鮮（xiān）培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培（péi）養基上（shàng），接種生孢梭（suō）菌的新鮮培養物至硫乙醇（chún）酸鹽流體培養基（jī）中（zhōng），30℃～35℃培（péi）養（yǎng）18小時～24小時；接種白色念珠（zhū）菌的新鮮培養物至改良馬丁（dīng）培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20℃～25℃培養24小時～48小時，上述培養物用（yòng） 0.9%氯化（huà）鈉溶液製成每1ml含菌數小於（yú） 100 cfu（菌落形成單位）的菌（jun1）懸液（yè）。接種黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23℃～28℃培養 5天～7天，加入 3ml～5ml 無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的0.9%氯化（huà）鈉溶液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出（chū）孢子（zǐ）懸液至無菌試管內，用無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨（lí）酯 80的0.9%氯化（huà）鈉溶液製成每 1ml含孢子數小於（yú）100 cfu的孢子懸液。
菌懸液在室溫下（xià）放置（zhì）應在2小時（shí）內使用，若保存在2℃～8℃可在24小時內使用。 黑曲黴孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
培養基接種 取每管裝（zhuāng）量為 12ml的硫乙（yǐ）醇酸鹽流體培養基 9支（zhī），分別接種（zhǒng）小於100 cfu的金黃色葡萄（táo）球菌、銅綠假單胞菌、枯（kū）草芽孢杆（gǎn）菌（jun1）、生孢梭菌各 2支（zhī），另 1支不接種作為空白對照，置30℃～35℃培養3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基（jī）5支,分別接種小於 100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各 2支，另 1支（zhī）不接種作為空白（bái）對照（zhào），置20℃～25℃培養5天。逐日觀察結果。
結果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管（guǎn）均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。
稀釋液、衝洗液及其製備方法
稀釋液、衝洗液配製後應（yīng）采用驗證合格的滅（miè）菌程序滅（miè）菌。
1. 0.1%蛋白腖水溶液 取蛋（dàn）白腖 1.0g，加水 1000ml，微溫溶解，濾清，調節 pH值至 7.1±0.2，分裝，滅菌。
2. pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液 取磷酸二氫鉀 3.56g ，磷酸（suān）氫二鈉 7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白腖 1.0g，加水 1000ml ，微溫溶解，濾（lǜ）清（qīng），分裝，滅菌（jun1）。
3. 0.9%氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌(僅（jǐn）用於上述兩種溶液不適用（yòng）時使用)。
4. 根據供試品的特性，可選用其他經驗證過的（de）適宜的溶液作為稀（xī）釋液、衝洗液。
如需要，可在上述稀釋液或衝洗液的滅菌前或滅菌後加入表（biǎo）麵活性劑或（huò）中和劑等。
方法驗證試驗
當建立產（chǎn）品的無菌檢查法（fǎ）時（shí），應（yīng）進行方法的驗證，以證明所采（cǎi）用的方法適合於該產品的無菌（jun1）檢查。若該產品的組分或原檢（jiǎn）驗條件發生改（gǎi）變時，檢查方法應重新（xīn）驗證。
驗證時，按"供試品（pǐn）的無菌檢查"的規（guī）定及下（xià）列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。
菌種及菌液製備 同培養基靈敏度檢查。
薄膜過濾法 取每種培養基規定接種的（de）供試品總量（liàng）按薄膜過濾法過濾，衝洗（xǐ），在最後（hòu）一次的（de）衝洗液中加入小於100 cfu的試（shì）驗菌，過濾。將培養基加至濾（lǜ）筒內。另（lìng）取一裝有同體積培（péi）養基的容器（qì），加入（rù）等量試驗菌，作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的（de）生長情況。
直接接（jiē）種法 取符合直接接種法培養基用（yòng）量要求的硫乙醇酸鹽流（liú）體培養基8 管，分別（bié）接入小於 100 cfu的金黃（huáng）色葡（pú）萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆（gǎn）菌、生（shēng）孢（bāo）梭菌各 2管，取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基 4管，分別接入小於（yú）100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各 2管。其中1管接入每支培養基（jī）規定量的供試品量，另 1管作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置（zhì）20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。
結果判斷 與對照管比較，如含供試品各（gè）容器中的試驗菌均（jun1）生長（zhǎng）良好，則說明供試（shì）品的該（gāi）檢（jiǎn）驗量在該檢驗條（tiáo）件下無抑（yì）菌作用或其抑（yì）菌作用可（kě）以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行（háng）供試品的無菌檢查。如（rú）含（hán）供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩（huǎn）慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條（tiáo）件下有抑菌作用，可采用增加衝洗量、增加培養基的用（yòng）量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品（pǐn）的抑菌作用，並重新進行方法驗證試驗（yàn）。
驗證（zhèng）試驗也可與供試品的無（wú）菌檢查同時進行（háng）。
供試品的無菌檢查
抽驗數量 是（shì）指一次試（shì）驗所（suǒ）用供（gòng）試品最小包裝（zhuāng）容（róng）器的數量（支或瓶）。成（chéng）品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定外，原液、半成品（pǐn）及成品按（àn）表1規定，上市（shì）產品監督檢驗按表2規定。
接種量 是（shì）指每個最小包裝的最少取樣量（liàng）（ml或g）。除另有規定外，接種供試品量按表3規定。若采（cǎi）用直接接種法，按接種量（liàng）要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽（yán）流（liú）體培養基（jī）和改良馬丁培養基中（兩種培養基的接種支/瓶數（shù）之比為2：1）；若采用薄膜過濾法，應采用三聯薄膜過濾器，其中兩聯加入硫乙醇（chún）酸鹽流體培養基（jī），另一聯加入改良馬丁培養基。隻要供試品（pǐn）特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾（lǜ）。
陽性對照 以（yǐ）金黃色（sè）葡萄球菌作為陽性對照菌（jun1）。供試（shì）品用量同（tóng）供試品無（wú）菌檢查每份培養基接種（zhǒng）的樣品量。陽性對照試（shì）驗的菌（jun1）液製備同培養基（jī）靈（líng）敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液製備方法，加菌量小於 100cfu。陽性對照（zhào）也可在供試品無菌檢查培養14天後，取其（qí）中一份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於 100cfu陽性對照菌，作（zuò）為（wéi）陽性對照。陽性對照置30℃～35℃培養 48小時～72小時應生長良好。
陰性對照 供試品無（wú）菌檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和衝洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使（shǐ）用表麵活（huó）性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生（shēng）物生長無毒性。
無菌檢查法包（bāo）括薄（báo）膜過濾法和直接接種法。隻要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗（yàn）條件（jiàn）應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的（de）消（xiāo）毒液對供試品容器表麵進行徹底消毒，如果供試（shì）品容器內有一定的真空度（dù），可用適宜（yí）的無菌器材（如帶有除菌過濾器的（de）針頭）向容器（qì）內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物（wù）。
供試品處理（lǐ）及接種培養（yǎng）基
除另有規定外，按下列方法進行。
1.薄膜過濾法
采（cǎi）用（yòng）封閉式（shì）薄膜過濾器，濾膜孔（kǒng）徑應不大於（yú） 0.45μm，直徑（jìng）約為 50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇（zé）濾（lǜ）膜材質。使（shǐ）用時，應保證濾膜在（zài）過濾前後（hòu）的完（wán）整性。
水溶性供試液過濾前先將少量的衝洗（xǐ）液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分幹燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及衝洗（xǐ）液覆蓋整個濾膜表麵。供試液經薄膜（mó）過（guò）濾後，若需要用衝洗液（yè）衝洗濾膜，每張濾膜每次衝洗量一般為100ml，總衝（chōng）洗量不得（dé）超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損（sǔn）傷（shāng）。
水溶液供試品 取規定（dìng）量，裝量小於（yú）10ml者，全部轉移至含適宜（yí）稀釋（shì）液300ml的無菌（jun1）容器內，混勻，立即過濾；裝量為10ml及以上者直接過濾，或全部轉移至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立（lì）即過濾。如（rú）供試品具有抑菌作用或含（hán）防腐劑，須用衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於三次，所用的衝洗量、衝洗方法同方法驗證試（shì）驗。衝洗後，兩個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml，另一濾器中（zhōng）加入改良馬丁培養基（jī）100ml。
水溶性固體供試品 取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明複溶，然（rán）後照水溶液供試品項下的方法操作。
非水溶性供試品 取（qǔ）規（guī）定量，混合溶於含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的（de）稀釋液（yè）300ml的無菌容（róng）器內，充分混合，立即過濾。用含0.1%～1%聚山梨酯80的衝洗液（yè）衝洗濾膜，衝洗次（cì）數一般不少於三次（cì）。加入（rù）含（hán）或不含聚山梨酯80的培（péi）養基。其他照水溶液（yè）供試（shì）品項下（xià）的方法操作（zuò）。
可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取（qǔ）規定量（liàng），混合至適（shì）量的無菌十四（sì）烷酸異丙酯①中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果（guǒ）需（xū）要可適當（dāng）加熱，但溫度（dù）不得超過44℃，趁熱迅（xùn）速過濾。對仍然無（wú）法過濾的供試品，於含有適量（liàng）的（de）無菌十四烷酸異丙酯中（zhōng）的供試液中加入（rù）不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相（xiàng）作為供試液過濾。過濾後濾膜衝洗及（jí）加入培養基照非水溶性製劑供試品項下的方法操作。
無菌（jun1）氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置至少－20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在（zài）容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑（jì）後（hòu）再無菌開啟容器，並將供試液（yè）轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。
裝有（yǒu）藥物（wù）的注射器供試品 取規定量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或標簽所示的（de）溶劑溶解）直接過濾，或混合（hé）至含適量稀釋液的無（wú）菌容器（qì）內，混勻，立即過（guò）濾。然後按水溶性供（gòng）試品項下方法操作。
同時應采用直接接（jiē）種法進（jìn）行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
注： ①無（wú）菌十四烷酸異丙酯（zhǐ）的製備 采用（yòng）薄（báo）膜過濾法過濾除菌。選用孔（kǒng）徑為0.22μm的脂溶性濾膜(140℃幹熱滅菌2小時)過濾。
2. 直接接種法
直（zhí）接接種法適用於無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。 取規定量供試品,等量分別接種（zhǒng）至硫乙醇酸鹽流體培養基（jī）和改良馬丁培養基中（zhōng）（兩種培養基的接種支/瓶（píng）數之（zhī）比為2：1）。除另有規定外，每個容器中（zhōng）培養基的用量（liàng）應符合接種的供試（shì）品體積不得大於培養基體積的（de） 10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於 15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。培養基的用量和高度同方法驗證試驗。
混懸液等非澄清水（shuǐ）溶液供試品 取規定量，等量（liàng）分別接種至各管培養基（jī）中。
固體供試品 取規（guī）定量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標簽（qiān）說明複溶後，混合，等量分別接種至各（gè）管培養（yǎng）基中。
非水溶性供試品（pǐn） 取規定量（liàng），混合，加入（rù）適量的聚山梨酯 80或（huò）其它適宜（yí）的乳化劑及（jí）稀釋劑使其乳（rǔ）化，等量（liàng）分別接種至各管（guǎn）培（péi）養基中。或等量分別直接接種至（zhì）含（hán）聚（jù）山梨（lí）酯 80或其它適宜乳化劑的各管（guǎn）培養基中。
培養及觀察
將上述（shù）接種後的硫乙醇（chún）酸鹽流體培養（yǎng）基平均分成兩份，一（yī）份置30℃～35℃培養 14天；另一份與接種（zhǒng）後的改良馬丁（dīng）培養基置20℃～25℃培養 14天，培養期間應逐日觀察（chá）並記錄是否有菌（jun1）生長。如在加入供試品後、或在培養過程中，培養基出（chū）現渾濁，培養 14天後（hòu），不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜麵和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上，細菌（jun1）培養 2天、真菌培養 3天，觀察（chá）接種的（de）同種新鮮培養基及營養瓊脂和改良（liáng）馬丁瓊（qióng）脂斜麵培養基上是否有菌生長；或取培養液（yè）（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作菌種鑒定。
結果判斷
陽（yáng）性對照管應生長良好，陰性（xìng）對（duì）照管不（bú）得有菌生長。否則，試驗無（wú）效。
若供試（shì）品管均澄清，或（huò）雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品（pǐn）符合規定；若（ruò）供試品（pǐn）管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品（pǐn）不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長（zhǎng）的微生物非供試品所含。當符合（hé）下列至少一個條（tiáo）件（jiàn）時方可判試驗結果無效：
⑴ 無菌檢查試驗所用的設備（bèi）及環境的（de）微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。
⑵ 回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生（shēng）物汙（wū）染的因素。
⑶ 供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因（yīn）無菌試驗中所使用的物（wù）品和（hé）（或）無菌操作技術（shù）不當引起的。
試（shì）驗若經確（què）認無（wú）效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品（pǐn）符合規定；若有（yǒu）菌生長，判（pàn）供試品不符合規（guī）定。
表1 出（chū）廠製品不同規（guī）格及原液和半成品最少抽驗數量
供試（shì）品
批產量(N)；裝（zhuāng）量（V）
最少抽驗數量
注射劑
N≤100
5個（gè）
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
凍幹血液製品
V＞5ml
每櫃凍幹N≤200個
5個
每櫃（guì）凍幹N＞200個（gè）
10個
V≤5ml
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
原液或半成品
每個容器取樣，取樣量為（wéi）每個容器製品總量的0.1%或不少於10ml。每開（kāi）瓶一（yī）次，應如上法抽驗。體外用診斷製品（pǐn）半成品每
批抽驗量應不少於3ml。
表2上市製品監督抽驗數（shù）量（liàng）
品種及（jí）裝量（V）
最少抽驗數量
血液製品 V＜50ml
6個
V≥50ml
2個
其（qí）他生物製品（pǐn）
10個
表3 不同規格製品的最少接種量
規（guī）格
每支（瓶）供試品的最少接種量
液體製劑（ml） ≤1
全量
1＜V≤5
半量（liàng）
5＜V＜20
2ml
20≤V＜50
10ml
V≥50
半量（liàng）
原液或半成品
半量
固體製劑 ＜50mg
全量
50mg≤M＜300mg
半量
300mg≤M＜5g
150mg
M≥5g
半（bàn）量
售前谘詢