附錄Ⅻ A 無菌檢查法（fǎ）
無菌（jun1）檢查法係用於檢查藥典要求無菌的生物製品、醫療器具、原（yuán）料（liào）、輔（fǔ）料（liào）、及其他品（pǐn）種（zhǒng）是否無菌的一種方法。若供試品符（fú）合無菌檢（jiǎn）查（chá）法的規定,僅表明（míng）了供試品在該檢驗條件下未發（fā）現微生物汙染。
無菌檢（jiǎn）查應在（zài）環境潔淨度 10 000 級下的局（jú）部潔淨度 100 級的單向流空氣區域內或隔（gé）離係統中進行，其全過（guò）程應嚴格（gé）遵（zūn）守無菌操作（zuò），防止微（wēi）生物汙染，防止汙染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作台麵及環（huán）境應定期按《醫（yī）藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮遊（yóu）菌和沉降菌的測試方法》的現（xiàn）行（háng）國家標（biāo）準進（jìn）行潔淨度驗證。隔離係（xì）統（tǒng）應按相關的（de）要求進（jìn）行（háng）驗證，其內部環境的潔淨度（dù）須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。
無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。
培養基（jī）
培養基的製備
培養（yǎng）基可按以下處方製備，亦可使用按該處方生產的符合（hé）規定的脫水培養（yǎng）基。配製後應采用驗證合格的（de）滅菌程（chéng）序滅菌。製備好的培養基應保存在 2℃～ 25℃、避光的環境，若保（bǎo）存（cún）於非密閉（bì）容器中，一般在三周內使用；若保存於密閉容器中，一般可在一年內使用。
1. 硫乙醇酸鹽流體培養基
酪腖 (胰（yí）酶水解) 15.0g 酵母（mǔ）浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化（huà）鈉 2.5g
L-胱氨酸（suān） 0.5g 新（xīn）配製的（de） 0.1% 刃天青溶液 1.0 ml
硫乙醇酸鈉（nà） 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天（tiān）青溶液外，取上述（shù）成分（fèn）混合，微溫溶解（jiě），調節 pH 為弱（ruò）堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節 pH 值使滅菌（jun1）後為 7.1 ± 0.2 。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的 1/2 ，滅菌。在供試（shì）品（pǐn）接種（zhǒng）前，培養基（jī）氧化層的高度不得超過培養基深（shēn）度的 1/5 ，否則，須經 100 ℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鍾），迅速冷卻，隻限加熱一（yī）次，並防止被汙染。
2.改良馬（mǎ）丁培養基
腖 5.0g 磷酸氫二（èr）鉀 1.0g
酵（jiào）母浸出粉 2.0g 硫酸鎂 0.5g
葡（pú）萄糖（táng） 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成（chéng）分混合，微溫溶解，調節 pH 值約為 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻（yún），濾清，調節 pH 值使滅菌後為（wéi） 6.4 ± 0.2 ，分（fèn）裝，滅菌。
3.選擇（zé）性培養基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅（miè）菌或使用前加入適宜的中和劑（jì）、滅活劑或表麵活性（xìng）劑，其用量同驗證試驗。
4.營養肉湯培養基
腖 10.0g 氯化鈉 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
5. 營養瓊脂（zhī）培（péi）養基
按上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入 14.0g瓊（qióng）脂（zhī），調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
6. 改良馬丁瓊脂培養基
按改良馬丁培養（yǎng）基的處方及製法（fǎ），加入 14.0g瓊脂，調節 pH值（zhí）使滅菌後為 6.4 ± 0.2，分裝（zhuāng），滅菌。
培養基的（de）適用性檢（jiǎn）查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基應符合培（péi）養基的無菌（jun1）性檢查及（jí）靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無（wú）菌檢查同時進行。
無菌性（xìng）檢查 每批（pī）培養基（jī）隨機抽取不少於（yú） 10 支（瓶），5支（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶（píng））置20℃～25℃培養 14 天，均應無菌生長.
靈敏度檢查
菌種：培養基靈敏（mǐn）度檢查所用的（de）菌株（zhū）傳代（dài）次數（shù）不得超過 5 代（從菌種保存中心（xīn）獲得的（de）冷凍幹燥菌種為第 0 代），試驗用菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證（zhèng）試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲黴( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液製備 接種（zhǒng）金黃（huáng）色葡萄球菌（jun1）、銅綠假單胞菌（jun1）、枯（kū）草芽孢杆菌的新（xīn）鮮培養（yǎng）物至營養肉湯培養基中或營養瓊（qióng）脂培養（yǎng）基上，接種（zhǒng）生孢梭菌的新鮮培養物至硫（liú）乙醇酸鹽流體培養基中，30℃～35℃培養18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20℃～25℃培養24小時～48小時，上述培養物用 0.9%氯化鈉溶液（yè）製成每1ml含菌（jun1）數小於 100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23℃～28℃培養 5天～7天，加入 3ml～5ml 無（wú）菌的含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉（nà）溶液，將孢子洗脫。然後，用（yòng）適宜的方法吸（xī）出孢（bāo）子懸（xuán）液（yè）至無菌試管內，用無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉溶（róng）液製成每 1ml含（hán）孢子數小於100 cfu的（de）孢子懸液。
菌懸（xuán）液在室（shì）溫下放置應在2小時內使用，若保存在（zài）2℃～8℃可在24小時內使用。 黑曲黴孢子懸液（yè）可（kě）保存在2℃～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
培養（yǎng）基接種 取每管裝量為 12ml的硫乙醇酸鹽（yán）流體培養基（jī） 9支，分別接種小於（yú）100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌（jun1）、生孢梭菌各 2支，另（lìng） 1支不接種作為空白對照，置30℃～35℃培養3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支,分別接種小於 100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各 2支，另 1支不接種作為空白對照，置20℃～25℃培養5天。逐日觀察（chá）結果。
結果判定（dìng） 空白（bái）對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生（shēng）長良好（hǎo），判該培（péi）養基的靈（líng）敏度檢查符合規定。
稀釋液、衝洗（xǐ）液及其製備方法
稀（xī）釋液、衝洗液配製後應采用驗證合格（gé）的（de）滅菌程序滅菌。
1. 0.1%蛋白腖水溶（róng）液（yè） 取蛋白（bái）腖 1.0g，加水（shuǐ） 1000ml，微溫溶（róng）解，濾（lǜ）清（qīng），調節 pH值至 7.1±0.2，分裝，滅菌。
2. pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液 取磷酸二氫鉀 3.56g ，磷酸氫二鈉 7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白腖 1.0g，加水 1000ml ，微溫溶解，濾清，分裝（zhuāng），滅（miè）菌。
3. 0.9%氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌(僅用於上述兩種溶液不適用時使用)。
4. 根據供試品（pǐn）的特性，可選用其他經驗證過（guò）的適宜的溶（róng）液作為稀釋液、衝洗（xǐ）液。
如（rú）需要，可在上（shàng）述稀釋液或衝洗液的滅菌前或（huò）滅菌後加入（rù）表麵活性劑或中和劑等。
方（fāng）法驗證試驗
當建立產品的無菌檢查法時，應進行方（fāng）法的（de）驗證，以證明所采用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原（yuán）檢驗條件發生改（gǎi）變時，檢（jiǎn）查方法（fǎ）應重新（xīn）驗證。
驗（yàn）證（zhèng）時，按"供試品的無菌檢查"的規定及下列要求進行操（cāo）作。對每一試驗菌應（yīng）逐一進行驗證。
菌種及菌液製備 同培（péi）養基靈敏度檢查。
薄膜過濾法 取每（měi）種培養基規定接種的（de）供試品總量按薄膜過（guò）濾（lǜ）法過濾，衝洗，在最後一次的衝洗液中加入小於100 cfu的試驗菌，過濾（lǜ）。將培養基加至濾（lǜ）筒內。另取一（yī）裝有同體積培養基的容器，加入（rù）等量試（shì）驗菌，作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察各濾筒內試驗（yàn）菌的生長情（qíng）況。
直接接種法 取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流（liú）體培養基8 管，分別（bié）接（jiē）入小於 100 cfu的（de）金黃色葡（pú）萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生（shēng）孢梭菌各 2管，取符合直接接種（zhǒng）法培養基用量要求的改良馬丁培養基 4管，分別接（jiē）入小於100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各 2管。其（qí）中1管接入每支培養基規定量的（de）供試品量，另 1管作為對照，細菌置（zhì）30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐（zhú）日觀察各濾（lǜ）筒內試驗菌的生長情況。
結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良（liáng）好，則說明供試品的（de）該檢（jiǎn）驗（yàn）量在該（gāi）檢驗條件下無（wú）抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不（bú）計，照此檢查方法（fǎ）和（hé）檢（jiǎn）查（chá）條件進（jìn）行供試品的無菌檢查。如含供（gòng）試品的任（rèn）一容器中的試驗（yàn）菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量（liàng）在該檢驗條（tiáo）件下有抑菌作用，可采用增加衝洗量、增加培養基的用量（liàng）、使（shǐ）用中和劑或滅活（huó）劑、更換濾膜品種等方法，消除供（gòng）試品的抑菌（jun1）作用，並重新進行方法驗證試（shì）驗。
驗證（zhèng）試（shì）驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品的（de）無菌檢查
抽驗數量 是指一次（cì）試驗所（suǒ）用供試品最小包裝容器的數量（liàng）（支或瓶）。成品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定（dìng）外，原液、半成品及成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2規定。
接種量 是指每個最小包裝的最少取樣量（liàng）（ml或g）。除另有規定外，接種供試品量按表3規定。若采用（yòng）直（zhí）接接種法，按接種量要求等量分別接（jiē）種（zhǒng）至硫乙醇酸鹽流體培養基（jī）和改良馬丁培養基中（兩種培養基的接種支/瓶數之比為2：1）；若（ruò）采用薄膜過濾（lǜ）法，應采用三聯薄膜過濾器（qì），其中兩聯加入硫乙（yǐ）醇酸（suān）鹽流體培（péi）養基，另一聯加入（rù）改良馬丁培養基。隻要供試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。
陽性對照 以金黃（huáng）色葡萄球菌作為陽性對照菌。供（gòng）試品用量同供試品無菌（jun1）檢查（chá）每份培養基接種的樣（yàng）品量。陽性對照試驗的菌液製備同（tóng）培養基靈敏度檢查項下金黃色葡（pú）萄（táo）球菌菌液製備方法，加菌量小於 100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢（jiǎn）查培養14天後，取其中一份硫（liú）乙醇酸鹽（yán）流體培養基，加入小於 100cfu陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對（duì）照置30℃～35℃培養 48小時～72小時應生長良好。
陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和衝洗液同法操作，作為陰性（xìng）對照。陰性（xìng）對照不得有菌生長。
無菌試驗過（guò）程（chéng）中，若（ruò）需使用表麵活性劑、滅活劑、中（zhōng）和劑等試劑，應證明其有效（xiào）性，且對微生物生長無毒性。
無菌檢查法包括薄膜過濾法（fǎ）和直接接種法。隻要（yào）供試品性狀允許，應采用（yòng）薄膜過（guò）濾法。供試（shì）品的無（wú）菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件（jiàn）應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的消毒液對供（gòng）試品容器（qì）表麵（miàn）進行徹底消毒，如果供試品容器內有一定的真（zhēn）空度，可用（yòng）適宜的無（wú）菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操（cāo）作起開容（róng）器取出內容物。
供試品處理及接種培養基
除另有規定外，按下列方法進行。
1.薄膜過濾法
采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑（jìng）應不大於（yú） 0.45μm，直徑約（yuē）為 50mm。根據供試品及（jí）其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完（wán）整性。
水溶性供試液過濾（lǜ）前先將（jiāng）少量的衝洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品（pǐn），其濾膜（mó）和過濾器在使用前應充分（fèn）幹燥。為發（fā）揮濾膜的最大過濾效率，應（yīng）注意保持供試品溶液及衝洗（xǐ）液（yè）覆蓋整個濾膜表麵（miàn）。供試液經薄膜過濾後，若需要用衝洗液衝洗（xǐ）濾膜，每張濾膜每次衝洗量一般（bān）為（wéi）100ml，總衝洗（xǐ）量不得超過1000ml，以避免（miǎn）濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供（gòng）試品 取規定量（liàng），裝量小於10ml者，全部轉移至含適（shì）宜稀釋液300ml的無菌容器（qì）內，混勻，立即過濾；裝量為10ml及以上者直接過濾，或全部轉移至（zhì）含（hán）適量稀（xī）釋（shì）液（yè）的無菌容器內，混勻（yún），立即過濾。如供（gòng）試品具有抑（yì）菌作（zuò）用或含（hán）防腐劑，須用衝洗液衝（chōng）洗（xǐ）濾膜，衝洗次（cì）數一般不少（shǎo）於三次，所用的衝洗量、衝洗方法同方法驗證試驗（yàn）。衝洗後，兩個（gè）濾器中加入硫乙醇酸鹽流（liú）體培養基各100ml，另一濾器中加入改良馬丁培養基100ml。
水溶性固體供試品 取規定（dìng）量，加適宜的稀釋液溶解（jiě）或按標簽說（shuō）明複溶，然後照水溶（róng）液供試品項下的方法操作。
非水溶（róng）性供試品 取規定量，混合溶（róng）於含聚山梨酯80或其他適宜（yí）乳化劑的稀釋液300ml的無（wú）菌容器內，充分（fèn）混（hún）合，立即過濾（lǜ）。用（yòng）含0.1%～1%聚山梨酯80的衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於三次。加（jiā）入含或不含聚山梨酯80的培養基。其（qí）他照水溶液供（gòng）試品項下的方法操作（zuò）。
可溶於十（shí）四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規定量，混合至適（shì）量的無菌（jun1）十四烷酸異（yì）丙酯①中，劇烈振搖，使（shǐ）供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫（wēn）度不得（dé）超過44℃，趁熱迅速過濾。對仍然無法（fǎ）過濾的供試品，於（yú）含有適（shì）量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加（jiā）入（rù）不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相（xiàng）作為供（gòng）試液過濾。過濾後濾膜衝洗及加入培養（yǎng）基照非水溶性製劑供試品項下（xià）的方法操作。
無菌氣（噴）霧劑供試（shì）品 取規定量，將各容器置至少－20℃的冰室（shì）冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鑽（zuàn）一（yī）小孔，釋放拋射劑（jì）後再無菌開啟容器，並將供試液轉移（yí）至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方（fāng）法操作。
裝有藥物的注射器供試品 取規定（dìng）量，將注（zhù）射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適（shì）量稀釋液的無（wú）菌容器內，混勻，立即（jí）過濾（lǜ）。然後按水溶性供試（shì）品項下方法操（cāo）作。
同時應采用（yòng）直接接種（zhǒng）法進行包裝中所（suǒ）配帶的無菌（jun1）針頭的無菌檢查。
注： ①無菌十四烷（wán）酸異丙酯的製（zhì）備 采用薄膜過濾法過濾除菌。選用（yòng）孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜(140℃幹熱滅菌2小（xiǎo）時)過濾。
2. 直接接種（zhǒng）法
直接接種法（fǎ）適用於無（wú）法（fǎ）用薄膜過濾法進行（háng）無菌（jun1）檢查的供試（shì）品。 取規定量供（gòng）試品,等量分別接種至（zhì）硫（liú）乙醇酸鹽流體培養（yǎng）基（jī）和改良馬丁培養基中（兩種培養基（jī）的接種支/瓶數之比為2：1）。除另有規定外，每（měi）個容器（qì）中培養基的用量應符合接種的供試品體積不（bú）得大於培養基體積的 10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於 15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。培（péi）養基的用量和高度同方法驗證試（shì）驗。
混懸液等非（fēi）澄清水溶液供試品 取規定量，等量分別接種至各管培養基中（zhōng）。
固體供試品 取規定量，加入適宜的稀釋劑溶解（jiě），或按標簽說明複溶後，混合，等量分別（bié）接種至各管培養基中。
非（fēi）水溶性供試品（pǐn） 取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯 80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使（shǐ）其乳化，等量分別接種至各管培（péi）養基中。或等量分別直接接種至含聚山梨酯 80或其它適（shì）宜乳化劑的各管培（péi）養基中。
培養及觀察
將上述接種後（hòu）的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成（chéng）兩份，一份置30℃～35℃培養 14天；另一（yī）份與接種後的改良馬丁培養基置20℃～25℃培養 14天，培養期間應逐日觀察並記（jì）錄是否有菌（jun1）生長。如在加入供試品後、或在培（péi）養過程中，培（péi）養基出現渾濁，培養 14天後，不能從外觀上（shàng）判斷有無菌（jun1）生長，可取該培養液適（shì）量轉種至同種新鮮（xiān）培養基（jī）中及營養瓊脂斜麵和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上，細菌培養 2天、真菌培養 3天，觀察接種的同種新（xīn）鮮培養（yǎng）基及營（yíng）養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜麵（miàn）培（péi）養基上是否有菌生長；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作菌種鑒定。
結果判斷
陽性對照管應生長良好，陰（yīn）性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。
若供試品管均澄清，或雖顯渾（hún）濁但經確證無菌生長，判供（gòng）試品符合規定；若供試（shì）品管中任何一管顯渾（hún）濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可（kě）判試驗結果無效：
⑴ 無菌檢查試驗所用的設備及環境的微（wēi）生物（wù）監控結果不符合無菌檢查（chá）法的要（yào）求。
⑵ 回顧無菌試驗過程，發現有（yǒu）可能引起微生物汙染的（de）因素。
⑶ 供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因（yīn）無菌（jun1）試驗（yàn）中所使用的物品和（或）無（wú）菌（jun1）操作技術不當引（yǐn）起的（de）。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量（liàng）供試品，依法檢（jiǎn）查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。
表（biǎo）1 出廠製品（pǐn）不同規格及原液和半成品最少抽驗數量
供試品
批產量(N)；裝量（V）
最少（shǎo）抽驗數量
注射劑
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
凍幹血（xuè）液製品
V＞5ml
每櫃凍幹N≤200個
5個
每櫃凍幹N＞200個
10個
V≤5ml
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
原液或半成品
每個容器取（qǔ）樣（yàng），取樣量為每個容器製品總量的0.1%或不少於10ml。每開瓶一次，應如上法（fǎ）抽驗。體外用診斷製（zhì）品半成品每（měi）
批抽驗量應不少（shǎo）於3ml。
表2上市製品監督抽驗數量
品種（zhǒng）及裝量（liàng）（V）
最少抽驗數量
血液製品 V＜50ml
6個（gè）
V≥50ml
2個
其他生物製品
10個
表3 不同規格製品的最少接種量
規（guī）格
每支（瓶）供試品的（de）最少（shǎo）接（jiē）種量
液體製劑（ml） ≤1
全（quán）量
1＜V≤5
半（bàn）量
5＜V＜20
2ml
20≤V＜50
10ml
V≥50
半量
原液或半成品
半量
固體製（zhì）劑 ＜50mg
全量
50mg≤M＜300mg
半量
300mg≤M＜5g
150mg
M≥5g
半量
售前谘詢（xún）