上海秉越電子儀器有限公司

產品采集與樣品（pǐn）處理

於同一批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個蕞小銷售包裝樣品，1/4樣（yàng）品用於檢測，1/4樣品用於留（liú）樣，另 1/2樣品（可就（jiù）地封存）必要時用於複檢。抽樣的蕞（zuì）小銷售包裝不應有破裂，檢驗（yàn）前不得啟（qǐ）開。

在100級淨（jìng）化條件（jiàn）下用無菌方法打開用（yòng）於（yú）檢測的至少 3個包裝，從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品。剪碎後加人到200ml滅菌（jun1）生理鹽水中，充分混勻，得到一個生理鹽水樣液（yè）。液體產品用原液直接做（zuò）樣液。

如（rú）被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時，稀釋液量可按每次 50ml遞增，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總（zǒng）數時相應調整稀釋度。

B2  細（xì）菌菌落總數與初始汙染菌（jun1）檢測方法

本方法適用於產品初始汙染（rǎn）菌與（yǔ）細菌菌（jun1）落總數（以（yǐ）下統稱為細菌菌落（luò）總數）檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降後取上清液作菌落計數。共接種 5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液，然後（hòu）用冷卻至45℃左右的熔化的營（yíng）養瓊脂培養基 15～20ml倒人每個平皿內混合均勻 。待瓊脂凝固（gù）後（hòu）翻轉平皿置 35℃±2℃培養（yǎng） 48h後，計算平板上的菌落數。

B2.2 結果報告

菌落呈片狀（zhuàng）生長的平板不宜采用；計數符合要求的平板上的菌落，按式（B1）計算結果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL；

A——5塊營養瓊脂培養（yǎng）基平板上的細菌菌落總數；

K——稀釋度。

當菌（jun1）落數在 100以內，按實有數報告，大於 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過（guò）本標準的規定，按 B2.3進行複檢和結果報（bào）告。

B2.3 複檢方法

將留存的複檢樣品依前法複測 2次，2次結果平（píng）均值都達到本標準的規（guī）定（dìng），則判定被檢樣品合格；其中有任何 1次結果平均值超過本（běn）標準（zhǔn）規（guī）定，則（zé）判定被（bèi）檢樣品不合格。

B3  大腸菌群（qún）檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣（yàng）液 5ml接種 50ml，乳糖（táng）膽鹽發酵管，置 35℃±2℃培養 24h，如不產酸也不產氣，則報告為大腸菌群（qún）陰（yīn）性。

如產酸產氣，則劃線接種伊（yī）紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養 18～24h，觀察（chá）平板上菌落形態。典型的大腸菌落為黑紫色（sè）或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表麵光滑濕（shī）潤，常具有金屬光（guāng）澤，也有（yǒu）的（de）呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或（huò）粉紅色，中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢（jiǎn），同時接種乳糖發醉管，置 35℃±2℃培（péi）養（yǎng） 24h，觀察（chá）產氣情況。

B3.2 結果報告

凡乳糖膽鹽發酵骨產酸產氣，乳糖發酵（jiào）管產酸產氣，在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞杆菌，可報告被檢樣品檢出大（dà）腸杆（gǎn）菌。

B4  綠膿杆菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml，加人到（dào）50ml SCDLP培（péi）養液中（zhōng），充分混勻，置 35℃±2℃培養 18～24h。如有綠膿杆菌生長（zhǎng），培養液農麵呈現（xiàn）一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或（huò）藍綠色。從培養液的薄菌膜（mó）處挑取培養物，劃線接種十六烷三甲基溴化胺（àn）瓊脂平板，置（zhì） 35℃±2℃ 培養 18～24h，觀（guān）察菌（jun1）落特征。綠膿杆菌（jun1）在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣（yuán）不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色，其他菌不（bú）長。

取可疑菌落塗片作革蘭氏染色，鏡檢（jiǎn）為革（gé）蘭氏陰性菌者（zhě）應進行下列試驗：

氧化酶試驗：取一小塊潔淨的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取可疑（yí）菌落塗在濾紙片上，然後在其上滴加一滴新配製的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅色（sè）或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗：取2-3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養基斜麵，35℃±2℃培養（yǎng）24h，加（jiā）入 3～5ml，充分振蕩（dàng）使培養物中可能存在（zài）的綠膿菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈藍色時，用吸管（guǎn）移到另一試管中並加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩後靜置片刻。如上層出現粉紅色或（huò）紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

硝酸鹽還原產氣試驗：挑取被檢菌落（luò）純培（péi）養物接種在硝酸鹽脈（mò）水培養（yǎng）基中，置 35C12C培養24h培養基小倒管（guǎn）中有氣者即為（wéi）陽性

明膠液化試驗:取可疑菌落純（chún）培養物，穿刺接種在明膠培養基內（nèi），置 35℃±2℃培養 24h，取出放於4～10C，如仍呈液態為陽性，凝固者為陰性（xìng）。

42℃生長試驗：取可疑培養物，接種在普通瓊脂斜麵培（péi）養基上，置 42℃培養 24～48h，有綠膿杆菌生長為陽性。

B4.2 結果報告

被檢樣品經（jīng）增菌（jun1）分離培養後，證實（shí）為革蘭氏陰性杆菌，氧化酶及綠膿（nóng）杆菌試驗均為陽性者，即可報告被檢（jiǎn）樣（yàng）品中（zhōng）檢出綠膿杆菌 如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍（réng）可報告被檢樣品中檢出綠膿杆菌。

B5 金黃色葡（pú）萄球菌檢測方法

B5.1 操作步驟

取樣液 5ml，加入到 50mL SCDLP培養液中，充分混勻（yún），置 35℃±2℃培（péi）養 24h，自上述增菌液中取1～2接種環，劃線接種在血瓊脂培養基上，置 35℃±2℃培養（yǎng）24～48h。在血瓊脂（zhī）平板上該菌菌落呈金（jīn）黃色，大而突起，圓形（xíng），不透明，表麵光滑，周圍有溶血圈。

挑取典型菌落，塗片作（zuò）革蘭氏染色鏡（jìng）檢，金黃（huáng）色葡萄球菌為革蘭氏陽性（xìng）球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢（jiǎn）符合 上述情況，應進行下列試驗：

甘露醇發（fā）酵試驗：取上述菌落接種（zhǒng）甘露醇培養（yǎng）液，置 35℃±2℃培養 24h，發酵甘露醇（chún）產酸者為陽性。

血漿凝固酶試驗：（1）玻片法：取清潔幹燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另（lìng）一端滴加一滴（dī）兔血漿，挑:取菌落分別與生理鹽水（shuǐ）和血漿混合，5min如血漿內出現團塊或顆粒（lì）狀凝塊，而（ér）鹽水滴仍（réng）呈均勻混濁無凝固則（zé）為陽性，如兩者均無（wú）凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝（níng）固現象，再進（jìn）行試管凝固酶試驗；（2）試（shì）管法：吸取 1：4新（xīn）鮮血漿 0.5ml，放滅（miè）菌（jun1）小試管中，加入（rù）等量待檢（jiǎn）菌 24h肉湯培養物 0.55mL，混勻，放 35℃±2℃溫箱或水浴中，每半（bàn）小時觀察一次，24h之內呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和（hé）陰性菌株肉湯（tāng）培養物各0.5ml，作為陽性與陰性對照。

B5.2 結果（guǒ）報告

凡在瓊脂平板上（shàng）有可疑菌落生長，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌，並能發酵甘露醇產酸，血漿凝固酶試驗（yàn）陽（yáng）性（xìng）者，可報告被檢樣品檢出（chū）金黃色葡萄球菌。

B6 溶血性鏈球（qiú）菌檢測方法

B6.1 操（cāo）作步驟

取樣（yàng）液 5ml加人到 50ml葡萄糖肉湯， 35℃±2℃培養 24h，將培養物劃線接種血瓊脂（zhī）平板， 35℃±2℃培養24h觀察菌落特征。溶血性鏈球（qiú）菌在血平板上為灰自色，半透明或不透明，針尖狀突起，表麵光滑，邊緣整齊，周圍有無色透（tòu）明溶血圈。

挑取典型菌落作塗片革蘭氏染色鏡檢，應為革蘭氏陽性，呈鏈狀排列的球（qiú）菌。鏡檢符合上述情況，應進行下列（liè）試驗：

鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 0.2ml（0.01g草酸鉀加5mL兔（tù）血漿混勻（yún），經離（lí）心（xīn）沉澱，吸取上清液），加人 0.8ml滅菌生理鹽水，混勻後（hòu）再加人待（dài）檢菌 24h肉（ròu）湯培養（yǎng）物0.5ml和（hé）0.25%氯化鈣0.25ml，混勻，放 35℃±2℃水浴（yù）中，2min觀（guān）察一次（一（yī）般10min內可凝固（gù）），待血（xuè）漿凝固（gù）後繼續觀察並記錄溶（róng）化時（shí）間。如（rú） 2h內不溶化，繼續（xù）放置 24h觀察（chá），如凝塊全部溶化為（wéi）陽性，24h仍不溶化為陰性。

杆菌膚敏感試驗：將被檢菌菌液塗於血平板上，用滅菌鑷子取每片含 0.04單位杆菌膚的紙片放在（zài）平板表麵仁，同（tóng）時（shí）以已知陽（yáng）性菌株作對照，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌帶者為陽性。

B6.2 結果報告

鏡檢革蘭氏陽性鏈狀（zhuàng）排列球菌，血平（píng）板上呈現溶血圈（quān），鏈（liàn）激酶和（hé）杆菌膚試驗陽性，可（kě）報告被（bèi）檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總（zǒng）數檢測方法

B7.1 操（cāo）作步驟

待上（shàng）述生（shēng）理（lǐ）鹽（yán）水樣（yàng）液自然沉降後取上清液作真菌計數（shù）。共接種5個（gè）平皿（mǐn），每個平皿中（zhōng）加人 1ml樣液，然後用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基 15 ～25mL倒人每（měi）個平皿內混合均勻，瓊脂凝固後翻轉平皿置 25℃±2℃培養 7天（tiān），分別於 3，5，7天觀察，計算平板上的（de）菌落數，如果發現菌落蔓延（yán），以前 一（yī）次的菌（jun1）落計數為準。

B7.2 結果報告

菌落呈片狀生（shēng）長的平板不宜采用；計數符合要求的（de）平板上的菌落，按式（B2）計算結果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落總（zǒng）數，cfu/g或cfu/mL；

B—–5塊沙（shā）氏瓊脂培養基平板上的真菌菌落總數;

K—–稀釋度。

當菌（jun1）落數在 100以內（nèi），按實有數報告，大於 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數（shù）超過本標準的規（guī）定，按 B7.3進行複檢和結果報告。

B7.3 複檢方法

將留存的（de）複檢（jiǎn）樣品依前法複測 2次，2次結果都達（dá）到本標準的規定，則判定被（bèi）檢樣品合格；其中有任（rèn）何 1次結果超（chāo）過本標準規定，則判定（dìng）被檢樣品不合（hé）格。

B8 真菌定性檢測方法

B8.1 操作步驟

取（qǔ）樣液 5mL加入到50mL沙（shā）氏（shì）培養（yǎng）基中， 25℃±2℃培養 7天，逐日觀察有無真菌生長。 

B8.2 結果報告

培（péi）養管混濁應轉種沙氏瓊脂（zhī）培（péi）養基，證實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出真菌。