上海秉越電子儀器有限公司

1.有機物中的（de）胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化（huà）生成（NH4）2SO4
反應式（shì）為
2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中（zhōng）CuSO4做催化劑（jì））
2.在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出（chū）NH3，收集（jí）於H3BO3溶液中
反應式為:
（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4
2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O
3.用已知濃度的（de）H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含（hán）量，然後乘以（yǐ）相應的換算因子，既得蛋白質的含量點焊（hàn）機
反應（yīng）式為：
（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

凱氏定氮儀操作步驟：（一）消化1、準備6個凱氏（shì）燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入（rù）適當（dāng）濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到（dào）燒瓶底部，切勿沾在瓶口（kǒu）及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃（nóng）硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶（píng）作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物（wù）質（zhì），對（duì）樣品測定進行校正（zhèng）。4、5、6號（hào）燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替（tì）樣（yàng）液，其餘所加試劑與（yǔ）1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶（píng）放置消化架上，接好抽氣裝置。先用（yòng）微火加熱煮沸，此時燒瓶內物質炭（tàn）化變黑，並（bìng）產生大量泡（pào）沫，務必注意防止氣泡衝出管（guǎn）口。待泡沫消失停止產生後（hòu），加大火力，保持瓶內液體微沸，至溶液澄清後，再繼續加熱使消化液微沸15min。在（zài）消化過程中要隨時轉動燒瓶，以使內壁粘著物質均能流入底（dǐ）部（bù），以（yǐ）保證樣品完（wán）全消化。消化時放出的氣體（tǐ）內含SO2，具有強烈刺激性，因（yīn）此自始（shǐ）自終應打開抽水泵將氣體抽入自（zì）來水排出。整（zhěng）個消化過程均應在通風（fēng）櫥中進行。消化完全後，關閉（bì）火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸餾和吸收蒸餾和吸（xī）收是在微量凱氏定氮（dàn）儀內進行的。

凱氏定（dìng）氮蒸餾裝置種類（lèi）甚多，大體上都由蒸氣發生、氨的蒸餾和氨的吸（xī）收三部（bù）分組成。

1、儀器的洗（xǐ）滌儀器安（ān）裝（zhuāng）前，各部件（jiàn）需經一般方法洗滌幹淨，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液（yè）中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗（xǐ）數次，然後安裝並固定在（zài）一（yī）隻鐵架台上。儀器使用前，微量全（quán）部管道都須經水（shuǐ）蒸氣洗滌，以除去管（guǎn）道內可能殘留的氨，正在使用（yòng）的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重複蒸氣洗滌，不（bú）得少於三次，並檢查儀器是否（fǒu）正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先（xiān）在蒸氣（qì）發生（shēng）器中（zhōng）加約2/3體積蒸餾水（shuǐ），加入數滴硫酸使其保持酸性，以避免水（shuǐ）中的氨被蒸出而影響結果（guǒ），並放入（rù）少許沸石（或毛細管等），以防（fáng）爆（bào）沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經插（chā）管流入反應室（shì），但玻（bō）杯內的水不要放光，塞上棒狀玻塞（sāi），保持水封，防（fáng）止漏氣（qì）。蒸氣發生後，立即關（guān）閉廢液排（pái）放管（guǎn）上的開（kāi）關，使蒸（zhēng）氣隻能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰，蒸出蒸（zhēng）氣（qì）由反應室上端口（kǒu）通過（guò）定（dìng）氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置（zhì）一個錐形瓶接（jiē）收冷凝水。從定氮球發燙開始（shǐ）計時，連續蒸（zhēng）煮5min，然後移開煤氣燈。衝洗完畢，夾緊蒸氣發（fā）生器與收集器之間的連接橡膠管，由於氣體（tǐ）冷卻壓力降（jiàng）低（dī），反應室內廢液自動抽到（dào）反應室外殼中，打開廢液排出口夾（jiá）子放出廢（fèi）液。如此清洗2～3次，再在冷凝（níng）管下換放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形（xíng）瓶內（nèi）的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內部已洗幹淨。移（yí）去錐（zhuī）形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水衝洗冷凝器下（xià）口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使（shǐ）用。

2、無（wú）機氮標準（zhǔn）樣品的蒸餾吸收由於定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和（hé）滴定（dìng）的操作技術，初學者宜先用無機氮標準樣品進行反複練習，再進行有（yǒu）機氮未知樣品的測定。常用（yòng）巳知濃度的標（biāo）準硫酸銨測試三次。取潔淨的100mL錐形（xíng）瓶五隻，依次加入2%硼酸溶液20mL，次（cì）甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一隻錐形瓶承接在冷凝管下（xià）端，並使冷凝管（guǎn）的出口浸沒在溶（róng）液（yè）中。注意：在此操（cāo）作之前必須先打（dǎ）開收集器活塞，以免（miǎn）錐（zhuī）形瓶內（nèi）液體倒吸。準（zhǔn）確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻（bō）杯中，小心提起（qǐ）棒狀玻塞使硫酸銨溶（róng）液慢慢流入（rù）蒸餾瓶中，用少量蒸餾水衝洗（xǐ）小玻（bō）杯3次，一並放人（rén）蒸（zhēng）餾瓶中。然後用量筒（tǒng）向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢流（liú）入蒸餾瓶中，在（zài）堿（jiǎn）液尚未完全流入時，將棒狀玻（bō）塞蓋緊。向（xiàng）小玻杯中加約（yuē）5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸（zhēng）餾（liú）瓶，一半留在小玻杯中作（zuò）水封。關閉收集器活塞，加熱蒸氣發生器，進（jìn）行蒸餾（liú）。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由於吸收（shōu）了氨，由紫紅色變（biàn）成綠色。自變色時起（qǐ），再蒸餾3～5min，移動錐（zhuī）形瓶使瓶內（nèi）液麵離開冷（lěng）凝管下口約lcm，並用少量蒸餾水衝洗冷凝管下口（kǒu），再繼續蒸（zhēng）餾1min，移開（kāi）錐形瓶，蓋好，準備（bèi）滴定。在一次蒸餾完畢後，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發生器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液（yè），用水衝洗小玻杯幾次，並將廢液排除（chú）。如此反複（fù）衝洗幹淨後，即可進行下一個樣品的蒸（zhēng）餾。按以上方法用標準硫酸銨再（zài）做兩次。另取2mL蒸餾水代替標（biāo）準硫酸銨進行空（kōng）白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。

3、未知樣品及空白的蒸餾吸收將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液（yè）三（sān）支，依次作蒸餾吸收。加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣（yàng）品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應室中，再（zài）用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水（shuǐ）量約3mL，洗滌液一並倒入（rù）反（fǎn）應室內。其餘操作按標（biāo）準硫酸銨的蒸餾（liú）進行（háng）。由於消化（huà）液內硫酸（suān）鉀濃度（dù）高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內倒出，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結晶析出，必須微熱溶解（jiě），趁熱加入玻杯，使其流入反（fǎn）應室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未完全（quán）冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結（jié）晶，造成堵塞。（三）凱氏定氮儀滴定樣品和空白蒸餾（liú）完畢後（hòu），一起進行滴定。打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定（dìng）管以0.0100mol/L的（de）標準鹽酸溶（róng）液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈暗（àn）灰色時，用蒸餾水將錐形瓶內壁四周淋洗（xǐ）一次。若振搖（yáo）後複現綠色，應再小心滴入（rù）標準鹽酸溶液半滴，振搖（yáo）觀察瓶（píng）內（nèi）溶（róng）液顏色變化，暗灰色在一二分鍾（zhōng）內不變，當視為到達滴定終點。若呈（chéng）粉紅色，表（biǎo）明已超越滴定終點，可在已滴定（dìng）耗用的標準鹽酸（suān）溶液用（yòng）量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白（bái）對照液接受瓶內的溶液顏色不變（biàn）或略有變化（huà）尚未出現綠色，可以不滴定（dìng）。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數，供計算用。