上海秉越電子儀器有限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產（chǎn）品質量（liàng）指標測（cè）試中超出已經建立的可接受標準的單個或一係列結果。無菌（jun1）產品的陽性結（jié）果、微生物限度試（shì）驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標（biāo）準等均為（wéi）OOS結果《中國藥典》2015年版m和新版（bǎn）《藥品生產質量管理規範》（GMP)增加（jiā）了（le）OOS調查章節，對微生物（wù）實驗室00S結果的調查做出了（le）較為詳細的闡述和實例分析，要求（qiú）任何OOS結果必須按（àn）照書麵規（guī）程進行（háng）完整（zhěng）的調查。因為隻有確定了（le）OOS結果產生的原因並判定其是否有效，進而才能製訂（dìng）完善的預防（fáng）和整改措施，以（yǐ）保證檢驗（yàn）結（jié）果的準確性。因此，實驗室建立OOS調查處理程（chéng）序，對OOS結果進行科學、及時、有效的調查分析處理是十分必要的微生物在自然（rán）環境中無處不在，並可能會隨檢驗（yàn）人員、檢驗用器材以及檢品的包裝容器進入檢驗環境。因此，關於（yú）微生物檢驗中藥品的無菌檢査項目，新版藥典對（duì）其操作環境提出了更高要求，新版GMP也加強（qiáng）了對無菌操作環境空氣微生物、表麵微（wēi）生物以及人員手（shǒu）套和（hé）操作服表麵微生物的監測頻率，並做出了明確規定。而對於無菌（jun1）檢査OOS結果的調査，需核實的相關記（jì）錄和影響因素（sù）更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查須追溯到實驗（yàn）過程的（de）每一個環節，而對於它的變異性，調查過程又需針對（duì）不同的OOS結果（guǒ）著重分析調查（chá）相應的不同環節。
對於微生物實驗室OOS的調查，局限於每個檢驗單位的技術水平（píng）和資（zī）源，同樣限於人（rén）類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調査都可以發現其根本（běn）原（yuán）因，但通過（guò）此調査過程（chéng）仍（réng）能夠幫助（zhù）調查者找出超標結果發生的可能原因並進（jìn）而采取糾正預防措施，基於風險分析，對相關批次產品做出最後處理決定（dìng）'從而降低藥品質量風險（xiǎn），既是保證藥品質量的重要工作，又是質量體係持續改進的原動（dòng）力。本文（wén）通過對4批無菌產品的無菌檢査實驗全過程的回顧性分析和調查，探索（suǒ）導致無菌實驗OOS結果的明確原因（yīn），以期建（jiàn）立微生物實驗室完善（shàn）的OOS調査方案。
1、材料、儀器與試劑
全自動智能無菌集菌儀(上海秉越（yuè）zw-2008)一次性使用全（quán）封（fēng）閉（bì）集菌（jun1）培養器顯微鏡AxiosescopeA
全自動微生物鑒定儀
酵母菌鑒定（dìng）卡
無菌檢查樣品為4個批號的注射用（yòng）頭孢（bāo）噻膀鈉。
2、方法與結果
2.1實驗方法
 
2.1.1藥品的無菌檢查
依照（zhào）《中國藥典（diǎn）》2010年版_檢驗（yàn）注射用頭孢噻肟鈉的無菌（jun1）檢查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照（zhào）儀器及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭氏染（rǎn）色，確定微（wēi）生物（wù）形態，然後根據形（xíng）態選擇鑒定卡（kǎ），使用全自動微生物鑒定儀（yí）Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號（hào）的注射用頭孢（bāo）噻肟鈉的無菌檢查檢驗結果如表1所示：2號（hào）和4號樣品改良馬丁培養基均在第3天（tiān）變渾濁。取改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣（yuán）整（zhěng）齊、形態（tài）單一的（de）菌落。
革蘭（lán）氏染色鏡檢（jiǎn）結果為酵母（mǔ）菌。經（jīng）全自動微生物鑒定（dìng）儀Vitek2Compact鑒定，均為季（jì）也蒙假絲酵（jiào）母。
 
3、OOS結果的調查（chá）和分析
依（yī）據新版GMP對OOS調查的要（yào）求（qiú），回（huí）顧性分析調查注射用（yòng）頭孢噻（sāi）肟鈉無菌檢查OOS結果產生的原因。
 
①日（rì）常監控和驗（yàn）收記錄：
培養基的驗收記錄、培養基的製備和滅菌記錄、檢（jiǎn）驗器具準備和滅菌記錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清潔消毒記（jì）錄、檢（jiǎn）驗員使用潔（jié）淨服的滅菌記錄（lù）和使用記錄、無菌檢驗操作記錄以及環境監控記錄等均未（wèi）發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人（rén）員均能熟練掌握無菌檢驗（yàn）的流程（chéng）、監控要點和無菌操（cāo）作規範。
③樣品：
確（què）認樣品的編號和批號無誤，無（wú）菌檢査取樣前，樣品西（xī）林瓶外觀正常，西林瓶蓋（gài）並未發現鬆動的跡象。
④實驗器具（jù）：
實驗中使用（yòng）的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以（yǐ）及一次性（xìng）使用無菌手套的無菌驗收（shōu）均符合規定，且用於當天（tiān）其他檢品的檢驗，並未發現汙染情況。
⑤培養基及衝洗液和稀釋液：
無菌檢查用培養基的陰性（xìng）對照均符合規定，且同批製備和滅菌的培養基（jī）用於同日檢查的其他檢品，並未發現汙染（rǎn）情（qíng）況。
⑥檢驗環境：
現場環境監控（kòng）的（de）3皿（mǐn）沉降菌監（jiān）測的TSA平皿均未有菌落生長，並未出現汙染情況。定期環境檢測表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日（rì）潔淨空調係統均運行正常。
⑦不同檢驗體係對結果判定造成的影響：
由於現行《中國藥典》無菌檢查使（shǐ）用的改良馬丁培養基不同於國際標準使用的TSB,將改良馬丁培養物劃線TSA平板上（shàng）長出的（de）菌落接種至TSB培養（yǎng）液中（zhōng）in),24h後培養液即（jí）出現（xiàn）混濁現（xiàn）象。因此可以排除因（yīn）檢驗體係不同造成的實驗結（jié）果偏差。
⑧菌株：
樣品檢出菌經鑒定為（wéi）季也蒙假絲酵母菌，比對曰常潔淨室監控收集的（de）菌株建（jiàn）立的菌庫，潔（jié）淨室中從未監測到此種（zhǒng）菌株。
⑨附加實驗的結果（guǒ）與分析：
通過以上分析，初步認定無菌不合格為實驗有效結果。但鑒於此次無菌檢驗過程並（bìng）未嚴格（gé）按照（zhào）新版GMP和《中國藥典》2015年版規定的對（duì）檢驗環境和人員的全麵監控，環境和人員（yuán）帶來的汙染（rǎn）仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對檢驗環境進行全（quán）麵監測。
現場環境監控按照新版GMP的要求實施，並增（zēng）加對潔淨室回風口浮遊菌的（de）監（jiān）測（cè），監測結果均符合（hé）規定。微生物監測方麵，除實驗人員無菌服胸口處采（cǎi）集到一個菌落，其他均未有菌落生長（zhǎng）。實驗人員無菌服采集到的菌落為革蘭氏（shì）陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在（zài）日常潔淨室監控中不止一次檢出過（guò），並未對樣品（pǐn）產生過汙染。
4、結（jié）論與討論
OOS結果表明（míng），並未在實驗室發現（xiàn）導致OOS結果的明確原因，檢出菌也並非由於實驗室檢驗過程帶（dài）來的汙染，懷疑樣品本（běn）身被季也蒙假絲酵母菌所汙染，從而導（dǎo）致無菌（jun1）檢查的陽性（xìng）結果。
通過對上述OOS的調（diào）查（chá）和分析（xī），初步（bù）建立了微生物實驗室OOS結果（guǒ）調查（chá）的分析方案，分別從人、機、料、法、環5個方麵進行闡述（shù）：
人——實驗人員。考察人員是否經（jīng）過相關（guān）檢（jiǎn）驗的培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無菌區全體人員（yuán）每年應進行（háng）一次再培訓和資（zī）格的再確（què）認，對無菌區（qū）人員操作服和手套表麵的微生物監測嚴格按新版GMP執行；
機——實驗（yàn）中使用的儀器設備。檢查集菌儀等儀器近期使用記錄是否發現異常，參數（shù）設（shè）置是否正確。儀器的計量和校準均需在有效期內，無菌區內（nèi）使用的儀器（qì）需定期消毒並定期（qī）進行微生物的表（biǎo）麵監測，使用的器具需經（jīng）滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗收；
料——樣品、培養基、稀釋液和衝洗液（yè）。檢（jiǎn）查剩餘樣品的編（biān）號和（hé）批（pī）號（hào）是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及樣品的前期存放（fàng）條件和取樣方式是否（fǒu）合理（lǐ）。必要（yào）時，對（duì）樣品（pǐn）的瓶蓋和瓶（píng）口等關鍵部位擦抹（mò）取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗（yàn）收記錄和配製記錄，確認（rèn）配製和滅菌是否合理有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和衝（chōng）洗液的（de）陰性對照應符合（hé）規定；
法——檢驗方法和依據（jù）。實驗所用標準應符合設定實（shí）驗和檢驗依據的要求；
環——實驗環境。檢查潔淨（jìng）空調係統（tǒng）是否運行正常，監測記錄包括定期（qī）監控記錄和實驗（yàn）現場環境監控（kòng）記錄，是否符合潔淨度要求，清（qīng）潔記錄顯示是否按時（shí）清潔，消毒液是否使用合理。另外（wài），未確定OOS結果產生的明確原因時，不（bú）能急（jí）於對環境進行消毒處理，以免忽略了可能的環境汙染因素。
 
微生物負荷和實驗檢出菌的比（bǐ）對分析。實驗室的微（wēi）生物負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表麵微生物和人員操作服及（jí）手套的表麵微（wēi）生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效鑒別和分析（xī），建立潔淨室生物負載數據庫，可為微生物（wù）OOS調査提供數據基礎（chǔ）。
 
對檢出菌進行（háng）鑒定，分析（xī）監（jiān）控收集的微生物分布和鑒定與陽性結果的相關性，當發現與陽性菌株（zhū）相近的菌株時，可利用分子生物學方法比對陽（yáng）性菌株與微生物負荷的同源性，為陽性菌的汙染（rǎn）溯源提供依據。
此外，對不（bú）同（tóng）實驗會產生不（bú）同的OOS結果，可針對（duì）某（mǒu）些相關環節靈活（huó）考（kǎo）察。例如，針對不同（tóng）的微生物，采用不同的監測手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增加沙氏葡（pú）萄糖瓊脂用於環境（jìng）監控的附加實驗，則能夠更好地確認環（huán）境中的該類微生物。
需要著重強調的是，檢出菌的鑒別對於（yú）OOS結果的調查非常（cháng）關鍵，決（jué）定最後是否可以發現根本原因（yīn），應該給予足（zú）夠重視。
綜上所述，微生物相（xiàng）關檢驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專業（yè）性強，實（shí）驗室不僅需要具備（bèi）受過良好培訓和具有豐富（fù）檢驗經驗的（de）工作人員，還需建立（lì）完善（shàn）的OOS調查方案來規範調查操作。