上海秉越電（diàn）子儀器有（yǒu）限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測試（shì）中超出已經建立的（de）可接受標準的單個或一係列結果。無菌產品的陽性結果、微生物限度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準等均為OOS結果《中國藥典》2015年版m和新版《藥品（pǐn）生產質量（liàng）管理（lǐ）規範》（GMP)增加（jiā）了OOS調查章節，對微生物（wù）實驗室00S結果的調（diào）查做出（chū）了較為詳細的闡述和實例分析，要求任何OOS結果必須按照書麵規程（chéng）進行完整的調查。因為（wéi）隻有確定了OOS結果產生的原因並判定其是否有效，進而才能製訂完善的預防和整改措施，以保證檢驗結果的準確性（xìng）。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對（duì）OOS結果進行科學、及時（shí）、有效的調查分析處理是十分必要的（de）微生物在自然環境中（zhōng）無處不（bú）在，並可能會隨檢驗人（rén）員（yuán）、檢驗用器材以及檢品的包裝（zhuāng）容器進入檢（jiǎn）驗環境。因此，關於微生物檢驗中（zhōng）藥（yào）品（pǐn）的無菌檢査項目，新版藥典對其（qí）操（cāo）作環境提出（chū）了更（gèng）高要求，新版GMP也（yě）加強了對無菌（jun1）操作環境空氣微（wēi）生物、表麵微生物以（yǐ）及人員手套和操作服（fú）表麵微生物的監測頻率，並做出了明確規定。而對於無菌檢査OOS結果的調査，需（xū）核（hé）實的相關記錄和影響因素更為繁雜。基於它的（de）複雜性，OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它的變（biàn）異性，調查過程又（yòu）需針對不同的OOS結果著重分析（xī）調查相應（yīng）的不同（tóng）環節。
對於微生物實驗室OOS的調查，局（jú）限於每個檢驗單位的技術水平和（hé）資源，同樣限於人類對微生物掌握的（de）局限，不是每次的OOS調査都可以發現其根本原因（yīn），但通過此調査過程（chéng）仍能夠幫助調查（chá）者找出（chū）超標結果（guǒ）發生的可能原因並進而采取糾正預防措施（shī），基（jī）於風險分析，對相關批次產品做出（chū）最（zuì）後處理決定'從而降低藥品質量風險，既是保證藥品質量的（de）重要工作，又是質量體係持續改進的原動力。本（běn）文通過對4批無菌產品的無菌檢査實驗（yàn）全過（guò）程的回顧性分析和調查，探索導致無菌實驗OOS結（jié）果的明確原因，以期建立微生物（wù）實驗室完善的OOS調査（chá）方案。
1、材料、儀器與試劑
全自動（dòng）智能無（wú）菌集菌儀(上海（hǎi）秉越zw-2008)一次性使（shǐ）用全封閉集菌培養器顯微鏡AxiosescopeA
全自動微生（shēng）物鑒（jiàn）定儀
酵母菌鑒定卡
無菌檢查樣品（pǐn）為4個批號（hào）的注射用頭孢噻（sāi）膀鈉。
2、方法與結果（guǒ）
2.1實驗方法
 
2.1.1藥品的無菌檢查
依照《中國藥（yào）典》2010年版_檢驗注射用（yòng）頭孢噻肟鈉的無菌檢查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平板（bǎn）培（péi）養24~48h，按照儀器及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然後根據形態選擇（zé）鑒定卡，使用全自動（dòng）微生物鑒定儀Vitek2Compact進（jìn）行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號（hào）的（de）注射用頭孢噻肟鈉的無菌（jun1）檢查檢驗結果如表1所示：2號（hào）和4號樣品改（gǎi）良馬丁培養基均在第（dì）3天變渾濁。取改良馬丁培養液劃（huá）線TSA平板，30~35℃培養（yǎng）48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣（yuán）整齊、形態單一的（de）菌落。
革蘭氏染色鏡檢結果為酵母菌。經全自動微生物鑒定儀（yí）Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵母。
 
3、OOS結果的調查和分析
依據新版GMP對OOS調查（chá）的要（yào）求，回顧性分析調查（chá）注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結果產生的原因。
 
①日常監控和驗收記錄：
培養基的驗收記錄、培養基的製備和滅菌（jun1）記（jì）錄、檢驗器具準備和滅菌記錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清（qīng）潔消毒記錄（lù）、檢驗員使用潔（jié）淨服的滅菌記（jì）錄和使用記錄、無菌檢驗操作記錄以及環境監控記（jì）錄（lù）等均未發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員均能熟練掌握無菌檢驗的流程、監控（kòng）要點和無菌操作（zuò）規範。
③樣（yàng）品：
確認樣品（pǐn）的編號和批號無誤，無菌檢査取樣前，樣品西林瓶外觀正常，西林（lín）瓶蓋（gài）並未發現鬆動的跡象。
④實驗器具：
實驗中使用的py330集菌器、一（yī）次件使用無菌（jun1）注射器以及一次性使用無（wú）菌（jun1）手（shǒu）套的無菌驗（yàn）收均符合（hé）規定，且用於當天其他檢品的檢驗，並未（wèi）發現汙染情況。
⑤培養基及衝（chōng）洗液和稀釋液：
無菌檢查用培養基的陰性對照均符合規定，且同批製（zhì）備和滅菌的培（péi）養基（jī）用（yòng）於同日檢查的其他檢品，並未發（fā）現汙染情況（kuàng）。
⑥檢驗環境：
現場環境監控的3皿沉（chén）降菌監測的（de）TSA平（píng）皿均（jun1）未有菌落生長，並未出現汙染情況。定期環境檢測表麵菌符合規（guī）定，樣品（pǐn）無菌檢查（chá）當日潔淨空調係統均運行正常。
⑦不同檢驗體係對結果判（pàn）定造成（chéng）的（de）影響：
由於現（xiàn）行《中國藥典（diǎn）》無菌檢查（chá）使用的改良馬丁培養基（jī）不同於國際標準使用的TSB,將改（gǎi）良馬丁培養物劃線TSA平（píng）板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因此可以排除（chú）因檢驗體係不同造成的實（shí）驗結果偏（piān）差。
⑧菌株：
樣品檢出菌經鑒定（dìng）為季也蒙假絲酵母菌，比對曰常潔（jié）淨室監控收集的菌株建立的菌（jun1）庫，潔淨室中（zhōng）從未（wèi）監測到此種菌（jun1）株。
⑨附加（jiā）實驗的結果與分析（xī）：
通過以上分析，初步認定無（wú）菌不合格為（wéi）實驗有效結果。但鑒於此（cǐ）次無菌檢驗過程（chéng）並未嚴格按照新版GMP和《中國藥典》2015年版規定的對檢驗環境和人員的全麵監控，環境和人員帶來的（de）汙（wū）染仍有造成（chéng）OOS結果的可能性（xìng），附加實驗就是對檢驗環境進行全麵監測。
現場環境監控（kòng）按照新版GMP的要求（qiú）實施，並增加對潔（jié）淨室回風口浮遊（yóu）菌的監測，監測結果均符合規定。微生物監測方麵，除實（shí）驗人員無菌服胸口處采集到一個菌落，其他均未有菌落生長。實驗人員無菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定（dìng）為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常潔淨室監控中不（bú）止一次檢出（chū）過，並未對樣品產生過（guò）汙染。
4、結論與討論
OOS結果（guǒ）表明，並未（wèi）在實驗室發現導致OOS結果的明確原因（yīn），檢出菌也（yě）並非由於實驗室檢驗過程帶來的（de）汙（wū）染，懷疑樣品（pǐn）本身被季也蒙假絲酵母菌所汙（wū）染，從（cóng）而導致無（wú）菌檢查的陽性結果。
通過對上（shàng）述OOS的調查和（hé）分（fèn）析，初步建立了微（wēi）生物實驗室OOS結（jié）果（guǒ）調查的分析方案（àn），分別從（cóng）人、機、料、法、環5個方麵進行闡述：
人——實驗人（rén）員。考察人員是否經過相關檢驗的培訓和（hé）考核，是否了解該項檢驗的流（liú）程和監控要點。無菌（jun1）區全體人員每年應進行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人員操作服和手套表麵的（de）微生物監測嚴格按新版GMP執行；
機——實驗中使用的儀器（qì）設備（bèi）。檢查集菌儀等儀器近期使用記錄（lù）是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和（hé）校準（zhǔn）均需在有（yǒu）效期內，無（wú）菌區內使用的（de）儀器需定期消毒並定期進行微生物的表麵監（jiān）測，使用的器具需（xū）經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗（yàn）收；
料（liào）——樣品、培養基、稀釋液和衝洗液。檢查剩餘樣（yàng）品的編號和批號是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及樣品的前期存放條件和取樣方式是（shì）否合理。必要時，對樣品的瓶蓋和瓶口等關（guān）鍵部（bù）位擦抹（mò）取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗收記錄和配製記錄，確（què）認（rèn）配製和滅菌（jun1）是否（fǒu）合理有效，是否（fǒu）用於其他樣品的檢驗，培（péi）養基、稀釋液和（hé）衝洗液的陰性對（duì）照應符合規定；
法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設（shè）定實（shí）驗和檢驗（yàn）依據的要求；
環——實驗環境。檢查潔淨空（kōng）調係統是否運行正常（cháng），監（jiān）測記錄包括定期監控記錄和實驗（yàn）現場環境監控記錄，是否符合潔（jié）淨度（dù）要求，清潔記（jì）錄顯示是否按時清潔，消毒（dú）液是否使用合（hé）理。另外，未確定OOS結果產生的明確原因時，不能急於對環境進行消毒處理，以免忽略了可能的環境汙（wū）染因素。
 
微生物負荷和實驗檢出菌的比對分析。實驗室的微生物負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表麵微生物和人（rén）員操作服（fú）及手（shǒu）套的表麵微生物。對日常環境（jìng）監控收集的菌株進行有效（xiào）鑒別和分析，建（jiàn）立潔淨室生物負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析（xī）監控收集的微生（shēng）物分布和鑒定與陽性（xìng）結果的相關性，當發現（xiàn）與陽（yáng）性菌株（zhū）相近的菌株（zhū）時，可利用分子（zǐ）生物（wù）學方法（fǎ）比對陽性菌株與微生物負荷（hé）的同源性，為（wéi）陽（yáng）性菌的汙染溯源提（tí）供依據（jù）。
此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相（xiàng）關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物（wù），采用不同的監測手段，陽性檢出菌（jun1）為酵母菌時，增加沙氏葡萄糖瓊脂用於環境監控的附加實驗，則能夠更好地確認環境中的該類微生物。
需要著重強調（diào）的是，檢出菌的鑒別對於OOS結果的（de）調查非常關鍵，決定最後是否可以發現（xiàn）根本原因，應該給予足夠重視。
綜上所述，微生物相關（guān）檢驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專業性強，實驗室不（bú）僅需要具備受過良好培訓和具有豐富（fù）檢驗經驗（yàn）的工作人員（yuán），還（hái）需建立完善的OOS調查方（fāng）案（àn）來規範調查操作。