上海秉（bǐng）越電子儀器有限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測（cè）試中超（chāo）出已經建立的可接受標（biāo）準的單（dān）個或（huò）一係列結果。無菌產品的陽性結（jié）果、微生（shēng）物限度試驗（yàn）超出行（háng）動值（zhí）或超過規格（gé）、內毒素試（shì）驗結果（guǒ）超（chāo）標準等均為OOS結（jié）果《中（zhōng）國藥典》2015年版（bǎn）m和新版《藥品生產質量管（guǎn）理規範》（GMP)增加了OOS調查（chá）章節，對微生物實驗（yàn）室00S結果的調查做出了較為詳細的闡（chǎn）述和（hé）實例分析，要求任何OOS結果必須按照書（shū）麵規程（chéng）進行完整的調查。因為隻有確定了OOS結果產生的原因並判定其是否有效，進而才能製（zhì）訂完善的預防和整（zhěng）改措施，以保證（zhèng）檢驗結果的準（zhǔn）確（què）性。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果進行科學、及時、有效的調查分析處理是十（shí）分（fèn）必要的微生（shēng）物（wù）在自然環境中無處不在，並可能會隨（suí）檢驗人員、檢驗用器材以及檢品的包裝容（róng）器進入檢驗環境（jìng）。因此，關於微生物檢（jiǎn）驗（yàn）中藥品的無菌（jun1）檢査（chá）項目，新（xīn）版藥典對其操作環境提出了更高要求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣（qì）微生物、表麵微（wēi）生物以（yǐ）及人（rén）員手套和操作服表麵微生物的監（jiān）測頻率，並做出了明確規（guī）定。而對於無菌檢査OOS結果的調査，需（xū）核實的（de）相關記錄和影響因素更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它的變異性，調查過程（chéng）又需針對不同的OOS結果著重分析調查相（xiàng）應的不同（tóng）環節。
對於微生物實驗室OOS的調查，局限於每（měi）個（gè）檢驗單位的技術水（shuǐ）平和資源，同（tóng）樣（yàng）限於人類對微生物掌握（wò）的局限，不是每次的OOS調査都可以發現（xiàn）其（qí）根（gēn）本原因，但通過此調査過程仍能夠幫助調查者找出超標（biāo）結果（guǒ）發生的可能原因並進而采取糾正預防措施，基於風險分析，對相關批次產品做出（chū）最後處理決定'從而降（jiàng）低藥品質量風險，既是保證（zhèng）藥品質量的重要工作，又是（shì）質量體係持（chí）續改進的原動力。本文通過對4批無菌產品的（de）無菌檢査實驗全過程的回顧性分析（xī）和調查，探索導（dǎo）致無菌實驗OOS結果的明確原因，以期建立微生物實驗（yàn）室完善的OOS調査方案。
1、材料、儀器與試劑
全自動智能無菌集菌儀(上海秉（bǐng）越zw-2008)一次（cì）性使用全封閉（bì）集菌培養器顯微鏡AxiosescopeA
全自動微生物鑒（jiàn）定儀（yí）
酵母菌鑒定卡（kǎ）
無菌檢（jiǎn）查樣品為（wéi）4個批號的注射用頭孢（bāo）噻膀（bǎng）鈉。
2、方法與結果
2.1實驗方法
 
2.1.1藥品的無菌檢查
依照《中國藥典（diǎn）》2010年版_檢驗注（zhù）射用頭孢（bāo）噻肟鈉（nà）的無菌檢查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按（àn）照儀器及試劑的使（shǐ）用說明，對經過（guò）純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然後（hòu）根（gēn）據形（xíng）態選擇鑒定卡，使用全自（zì）動微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號的注射用頭孢噻肟（wò）鈉的無菌檢查檢驗（yàn）結果如表1所示：2號和4號樣品改良馬丁培（péi）養基均在第3天（tiān）變渾濁。取改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板上呈現白色、光（guāng）滑、邊緣整（zhěng）齊、形態單一的菌落。
革蘭（lán）氏染色鏡（jìng）檢結果為酵母菌。經全自（zì）動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為（wéi）季（jì）也蒙假絲酵母。
 
3、OOS結果的調（diào）查和分析
依據新版GMP對OOS調查的要求，回顧性（xìng）分析調查注射用頭孢噻（sāi）肟（wò）鈉無菌檢查OOS結果（guǒ）產生的原因。
 
①日常監控和驗收記錄：
培養基的驗收記錄、培養基的製備（bèi）和滅菌記錄、檢驗器具準備和滅菌（jun1）記（jì）錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清潔消毒記錄、檢驗員使用潔淨服的滅（miè）菌記錄和使（shǐ）用記錄（lù）、無菌檢驗操作記錄以及環境監控記錄（lù）等均未發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員均能（néng）熟練掌握無菌檢驗的（de）流（liú）程、監（jiān）控要點和無（wú）菌操作規範。
③樣（yàng）品：
確認樣品的編號和（hé）批號（hào）無誤（wù），無菌檢査取樣前，樣品（pǐn）西林瓶外觀（guān）正常，西林瓶（píng）蓋並未發現鬆動的跡象（xiàng）。
④實驗器具：
實驗中使用的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一次性使用無菌（jun1）手（shǒu）套的無菌驗收均符合規定，且用於當（dāng）天其他檢品的檢驗，並未發現汙染情況。
⑤培養基及衝洗液和稀釋液：
無菌檢（jiǎn）查用培養基的陰性對照均符合規定，且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢查的其他檢品，並未發現汙染情（qíng）況。
⑥檢（jiǎn）驗環境：
現場環境（jìng）監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，並（bìng）未出現汙染情況。定期環境檢（jiǎn）測表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日潔淨（jìng）空（kōng）調係統均（jun1）運行正（zhèng）常。
⑦不同檢驗體係對結果判定造成（chéng）的影響：
由於現行（háng）《中國藥典》無菌檢查使（shǐ）用的改良馬丁培養基不同於國際標準使用的TSB,將（jiāng）改良馬丁培養物劃線（xiàn）TSA平板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因（yīn）此（cǐ）可以排除因檢驗體（tǐ）係不同造（zào）成的實驗結果偏差（chà）。
⑧菌株：
樣品檢出菌經鑒定為季也蒙假絲酵母菌（jun1），比對曰常（cháng）潔（jié）淨室監控收集的菌株建立的菌庫，潔淨室中從未監測到（dào）此種菌株。
⑨附加（jiā）實（shí）驗的結（jié）果與分（fèn）析：
通過以上分析，初步認定無菌不合格為實驗有效結果。但（dàn）鑒於此（cǐ）次無菌檢（jiǎn）驗過程並未嚴格按照新版GMP和《中國藥典》2015年版規定的對檢驗環境（jìng）和人員的全麵監控，環境和人員帶來的（de）汙染仍有造成OOS結（jié）果的可能性，附加實驗就是對檢驗環境進行全麵（miàn）監測。
現場環境監控按照新版GMP的要求實施，並增加對潔淨室回風口浮遊菌的監測，監測結果均符合規定（dìng）。微生物監測方麵，除實驗人員（yuán）無菌服胸口處采集到一個菌落，其他均未有菌落生長（zhǎng）。實驗人（rén）員無菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌（jun1），經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常（cháng）潔淨室監控中不止一次檢出過，並（bìng）未對樣品產生（shēng）過汙染。
4、結論與討論
OOS結果表明，並未在實驗室發現導致OOS結果的明確原因，檢出菌也並（bìng）非由於實驗室檢（jiǎn）驗過程帶來的汙染，懷（huái）疑樣品（pǐn）本身（shēn）被季也蒙假絲（sī）酵母菌所汙染（rǎn），從而導致無菌檢查的陽性結果。
通過對上述OOS的調查和分析，初（chū）步建立了微（wēi）生物（wù）實驗室OOS結果調查的分析（xī）方案，分別從人、機、料、法、環5個方麵進（jìn）行闡（chǎn）述：
人——實驗人員。考察人員是否經過（guò）相關檢驗的培訓和考（kǎo）核（hé），是否了解該項檢驗（yàn）的流程和監控要（yào）點。無菌區全體人員每年應進（jìn）行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人員操作服和（hé）手套表麵的微生物監測嚴格按新版GMP執行；
機（jī）——實驗中使用的儀器（qì）設備。檢查（chá）集菌儀等儀器近期使用記錄是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和校準均需在有（yǒu）效期內，無菌（jun1）區內使（shǐ）用的（de）儀器（qì）需定期（qī）消毒（dú）並定期進行微生物的表麵監測，使用的器具需經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量（liàng）驗收（shōu）；
料——樣品、培養基、稀釋液和衝（chōng）洗（xǐ）液。檢查剩餘樣品的編號和批號是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及樣品的前期存放條件和取樣方式是否合理。必要時，對樣品（pǐn）的瓶（píng）蓋和瓶口等關鍵部位擦抹取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗收記錄和配（pèi）製記錄，確認（rèn）配製和滅菌是否合理（lǐ）有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和衝洗液的陰性對照（zhào）應符合（hé）規定；
法——檢驗（yàn）方法和依據。實驗所用標準（zhǔn）應符合設定實驗和（hé）檢驗依（yī）據的要求；
環——實驗環境。檢查潔淨空調係統（tǒng）是否運行正常，監測記錄（lù）包括定期（qī）監控記（jì）錄（lù）和實驗現場（chǎng）環境監控記錄，是否（fǒu）符合潔淨度（dù）要求，清潔記錄顯示（shì）是否按時清潔，消毒（dú）液是否使用（yòng）合理。另外，未確定OOS結果（guǒ）產生的明確原因時，不能（néng）急於對環境進行消毒處理，以免忽略了（le）可能的環境汙染（rǎn）因素。
 
微生物負荷和（hé）實驗檢出（chū）菌（jun1）的（de）比對分析。實驗室的微生物負荷，包括潔淨室的空（kōng）氣微生物、表麵微生物和（hé）人員操作服及手套的表麵微生物。對日常環境（jìng）監控收集的菌株進行有效鑒別和分析，建立潔淨室生物（wù）負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據（jù）基（jī）礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分（fèn）析監控收集的微生物分布和鑒定與陽（yáng）性結果的相關性，當發現與（yǔ）陽性菌株相近的菌株時，可利用分子生物學方法比對陽性（xìng）菌株與微生物（wù）負荷（hé）的同源性，為陽性（xìng）菌的汙染溯源（yuán）提供依據。
此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物，采用不同的監測手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增加沙（shā）氏葡萄糖瓊脂用於環境監控的附加實驗，則能夠更（gèng）好（hǎo）地（dì）確（què）認環境中的該類微生物。
需要著重強調的（de）是，檢出菌的鑒（jiàn）別對於OOS結果（guǒ）的調查非常關鍵，決定最後是否可以發現根本原因，應該給予足夠重視。
綜上所述（shù），微生物相關檢驗（yàn）項目（mù）OOS結果的調查工作量很大，且專業性強，實驗室不僅需要具備受過良好培訓和具有豐富檢（jiǎn）驗經驗的工作人員，還需建立完善的OOS調查方案來（lái）規範調查操（cāo）作。